Chromatografia na reverznej fáze

Kvapalinová chromatografia na reverznej fáze (RPLC, reversed phase liquid chromatography) je metóda kvapalinovej chromatografie, ktorá na separáciu organických zlúčenín využíva nepolárnu stacionárnu fázu a polárnu mobilné fázu. Prevažná väčšina separácií a analýz pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) sa v posledných rokoch vykonáva v režime reverznej fázy. V režime reverznej fázy sú zložky vzorky zadržiavanéna chromatografickej kolóne tám viac, čím sú hydrofóbnejšie.

Faktory ovplyvňujúce zadržiavanie a separáciu rozpustených látok v chromatografickom systéme s reverznou fázou sú:

a. Chemická povaha stacionárnej fázy, t.j. substituenty viazané na povrchu, ako aj ich hustota a rozsah ich pokrytia.

b. Zloženie mobilnej fázy . Typ rozpúšťadiel, ktorých zmesi ovplyvňujú polaritu mobilnej fázy.

c. Aditíva v mobilnej fáze, ako sú pufre, ovplyvňujú pH a iónovú silu mobilnej fázy, čo ovplyvňuje stav ionizácie rozpustených látok a ich polaritu.

Stacionárne fázy, používané v chromatografii na reverznej fáze, pozostávajú z hydrofóbnych substituentov naviazaných na povrch poréznych častíc silikagélu, ktoré majú rôzny tvar (guľaté, nepravidelné), rôzny priemer častíc (2, 3, 5, 7, 10 μm), rôzny priemer pórov (60, 100, 150, 300 Å). Povrch častíc je pokrytý chemicky viazanými uhľovodíkmi, ako sú C3 (propyl), C4 (butyl), C8 (oktyl), C18 (oktadecyl) a inými. Čím dlhší je uhľovodík stacionárnej fázy, tým dlhšie budú hydrofóbne zložky vzorky zadržané na kolóne. Niektoré stacionárne fázy sú tiež vyrobené z hydrofóbnych polymérnych častíc alebo hybridizovaných častíc oxidu kremičitého s organickými skupinami určených pre mobilné fázy používané pri extrémnom pH. Väčšina súčasných metód separácie chromatografiou na reverznej fáze využíva kolóny C18, niekedy nazývané aj obchodnými názvami, ako ODS (oktadecylsilán) alebo RP-18.

Mobilné fázy používané v chromatografii na reverznej fáze sú zmesi vody a polárnych organických rozpúšťadiel, najmä metanol (lacnejší) a acetonitril. Mobilné fázy môžu obsahovať rôzne prísady, ako sú pufre (acetátový pufor, fosfátový pufor, citrátový pufor), povrchovo aktívne látky (alkylamíny alebo alkylsulfonáty) a špeciálne prísady (EDTA). Cieľom používania aditív v mobilnej fáze je zvýšiť účinnosť, selektivitu a kontrolovať zadržiavanie (retenčný faktor) rozpustenej látky.

Štruktúra silikagélu pred a po reakcii s oktadecyltrichlórsilánom (silylačné činidlo používané na prípravu reverznej fázy). Väčšina hydroxylových skupín silikagélu (hydrofilné, červené) bola prevedená na hydrofóbne alkylsiloxyskupiny.

História a vývoj stacionárnych fáz s reverznou fázou je podrobne popísaná v článku Majorsa, Dolana, Carra a Snydera.

V 70-tych rokoch 20. storočia sa väčšina pokusov kvapalinovej chromatografie uskutočňovala s použitím pevných častíc ako stacionárnych fáz vyrobených z nemodifikovaného silikagélu alebo oxidu hlinitého (aluminy). Tento typ techniky sa teraz označuje ako chromatografia na normálnej fáze. Pretože stacionárna fáza je pri tejto technike hydrofilná a mobilná fáza je nepolárna (pozostávajúca z organických rozpúšťadiel, ako je hexán a heptán), molekuly s hydrofilnými vlastnosťami vo vzorke silne adsorbujú na stacionárnu fázu. Okrem toho sa zle rozpúšťali v rozpúšťadlách mobilnej fázy. Zároveň hydrofóbne molekuly vykazujú malú afinitu k polárnej stacionárnej fáze a eluujú príliš skoro s nedostatočnou retenciou. To bol dôvod, prečo sa častice na báze oxidu kremičitého v 70. rokoch upravovali uhľovodíkmi, imobilizovali sa alebo sa viazali na ich povrch a mobilné fázy boli zmenené na polárne, aby bolo možné separovať aj látky, ktoré sa ťažko čistili na normálnej fáze.

Použitie hydrofóbnej stacionárnej fázy a polárnych mobilných fáz je v podstate opakom chromatografie s normálnou fázou, pretože polarita mobilnej a stacionárnej fázy bola obrátená – preto sa nazýva chromatografia na reverznej fáze. Výsledkom je, že hydrofóbne molekuly v polárnej mobilnej fáze majú tendenciu adsorbovať sa na hydrofóbnu stacionárnu fázu a hydrofilné molekuly vo vzorke prechádzajú cez kolónu a sú eluované ako prvé. Hydrofóbne molekuly možno z kolóny eluovať znížením polarity mobilnej fázy pomocou organického (nepolárneho) rozpúšťadla, ktoré znižuje hydrofóbne interakcie medzi analytom a stacionárnou fázou. Čím je molekula hydrofóbnejšia, tým silnejšie sa bude viazať na stacionárnu fázu a tým vyššia bude koncentrácia organického rozpúšťadla, ktorá bude potrebná na elúciu molekuly.

Mnohé z matematických parametrov teórie chromatografie a experimentálnych úvah používaných v iných chromatografických metódach platia aj pre RPLC (napríklad faktor selektivity, chromatografické rozlíšenie, počet teoretických poschodí a pod. Môže sa použiť na separáciu širokú škálu molekúl. Typicky sa používa na separáciu proteínov, pretože organické rozpúšťadlá používané v chromatografii s normálnou fázou môžu denaturovať mnohé proteíny.

Dnes je RPLC často používanou analytickou a preparatívnou technikou. Existuje veľké množstvo rôznych stacionárnych fáz dostupných na použitie v RPLC, čo umožňuje veľkú flexibilitu vo vývoji separačných metód.

Stacionárne fázy na báze silikagélu

Chemicky modifikované častice silikagélu sa bežne používajú ako stacionárna fáza vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii (HPLC) z niekoľkých dôvodov, vrátane:

1. Veľký povrch : Častice silikagélu majú veľký povrch, čo umožňuje priame interakcie s rozpustenými látkami alebo po naviazaní rôznych substituentov, sú možné rôzne typy interakcie s molekulami vzorky, čo vedie k lepším separáciám.
2. Chemická a tepelná stabilita a inertnosť: Silikagél je chemicky stabilný, pretože zvyčajne nereaguje ani s rozpúšťadlami mobilnej fázy, ani so separovanými zlúčeninami, výsledkom čoho sú presné, opakovateľné a spoľahlivé analýzy.
3. Široká použiteľnosť: Silikagél je všestranný a môže byť modifikovaný rôznymi funkčnými skupinami, vďaka čomu je vhodný pre širokú škálu analytov a aplikácií.
4. Efektívna separácia : Jedinečné vlastnosti častíc silikagélu v kombinácii s ich veľkým povrchom a ovplyvniteľným priemerom veľkosti pórov častíc uľahčujú efektívnu a presnú separáciu zlúčenín v HPLC.
5. Reprodukovateľnosť : Častice silikagélu umožňujú vysokú reprodukovateľnosť analýz, čo je kľúčové pre konzistentné a spoľahlivé analýzy HPLC.
6. Kontrola priemeru častíc a veľkosti pórov: Silikagél môže byť vyrobený tak, aby mal špecifické veľkosti pórov, čo umožňuje presnú kontrolu separácie na základe veľkosti molekúl.
7. Nákladová efektívnosť : Kremík je najrozšírenejším prvkom na Zemi, preto je silikagél cenovo výhodnou voľbou pre HPLC, vďaka čomu je široko používaný v laboratóriách.

Liekopis Spojených štátov amerických (USP) klasifikoval HPLC kolóny podľa L# typov. Najpopulárnejšou stacionárnou fázou v tejto klasifikácii je silikagél s viazanými oktadecylovými uhľovodíkovými reťazcami (C18) (USP klasifikácia L1). Potom nasleduje silikagél s naviazanými oktylovými uhľovodíkovými reťazcami (C8) (USP klasifikácia L7), nemodifikovaný silikagél (L3), silikagél s naviazanou kyanoskupinou (CN) (L10) a silikagél s naviazanou fenylovou skupinou (L11). Silikagély s naviazanými C18, C8 a fenylovými skupinami sú vyhradené stacionárne fázy s reverznou fázou, zatiaľ čo silikagély s naviazanými CN-skupinami možno použiť v režime s reverznou fázou v závislosti od podmienok analytu a mobilnej fázy. Nie všetky kolóny C18 majú rovnaké retenčné vlastnosti. Povrchová funkcionalizácia silikagélu môže byť uskutočnená v monomérnej alebo polymérnej reakcii s rôznymi organosilánmi s krátkym reťazcom, ktoré sa používajú v druhom kroku na pokrytie zostávajúcich silanolových skupín (end-capping silikagélu). Zatiaľ čo celkový retenčný mechanizmus zostáva rovnaký, rozdiely v povrchových chemických vlastnostiach rôznych stacionárnych fáz povedú k zmenám v selektivite.

Moderné kolóny majú rôznu polaritu v závislosti od ligandu naviazaného na stacionárnu fázu: PFP je silikagél s naviazanými pentafluórfenylovými skupinami, CN je silikagél s naviazanými nitrilovými skupinami, NH₂ je silikagél s naviazanými aminoskupinami, ODS je silikagél s naviazanými oktadecylovými (C18) skupinami. ODCN je zmiešaná kolóna pozostávajúca zo silikagélu s naviazanými oktadecylovými (C18) skupinami a nitrilovými skupinami.

Nedávny vývoj v chromatografických prístrojoch pre kvapalinovú chromatografiu (LC) uľahčil rýchle a vysoko účinné separácie pomocou rôznych geometrií stacionárnych fáz. Boli navrhnuté rôzne analytické stratégie, ako napríklad použitie monolitických nosičov na báze silikagélu, zvýšené teploty mobilnej fázy a kolóny naplnené povrchovo poréznymi časticami s veľkosťou menšou ako 3 μm alebo kolóny naplnené povrchovo poréznymi časticami s veľkosťou menšou ako 2 μm, ktoré obsahujú porézne častice na použitie v ultra-vysokotlakových LC systémoch (UHPLC).

Mobilné fázy

Obsiahly článok o moderných trendoch a osvedčených postupoch výberu mobilnej fázy v chromatografii na reverznej fáze publikovali Boyes a Dong. Mobilná fáza v chromatografii s reverznou fázou pozostáva zo zmesi vody alebo vodných tlmivých roztokov, ku ktorým sa pridávajú organické rozpúšťadlá na selektívnu elúciu analytov z kolóny s reverznou fázou. Pridané organické rozpúšťadlá musia byť miešateľné s vodou a dve najbežnejšie používané organické rozpúšťadlá sú acetonitril a metanol. Môžu sa použiť aj iné rozpúšťadlá, ako je etanol alebo 2-propanol (izopropanol) a tetrahydrofurán (THF). Organické rozpúšťadlo sa tiež nazýva modifikátor, pretože sa pridáva do vodného roztoku v mobilnej fáze, aby sa upravila polarita mobilnej fázy. Voda je najpolárnejším rozpúšťadlom v reverznej fáze mobilnej fázy; preto zníženie polarity mobilnej fázy pridaním organických rozpúšťadiel sa zvyšuje jej elučná sila. Dva najpoužívanejšie organické rozpúšťadlá sú acetonitril a metanol, hoci acetonitril je obľúbenejšia voľba. Môže sa použiť aj izopropanol (2-propanol) pre jeho silné elučné vlastnosti, ale jeho použitie je obmedzené jeho vysokou viskozitou, ktorá vedie k vyšším protitlakom. Acetonitril aj metanol sú menej viskózne ako izopropanol, hoci zmes 50:50 percent metanolu:vody je tiež veľmi viskózna a spôsobuje vysoké protitlaky.

Všetky tri rozpúšťadlá sú v podstate UV transparentné. Toto je zásadná vlastnosť pre bežnú chromatografiu s reverznou fázou, pretože zložky vzorky sú typicky detegované UV detektormi. Acetonitril je transparentnejší ako ostatné organické rozpúšťadlá v rozsahu nízkych UV vlnových dĺžok, preto sa používa takmer výlučne pri separácii molekúl so slabými alebo žiadnymi chromofórmi (UV-VIS absorbujúce skupiny), ako sú peptidy. Väčšina peptidov absorbuje len pri nízkych vlnových dĺžkach v ultrafialovom spektre (typicky menej ako 225 nm) a acetonitril poskytuje oveľa nižšiu absorbanciu pozadia pri nízkych vlnových dĺžkach ako ostatné bežné organické rozpúšťadlá.

pH mobilnej fázy má významný vplyv na retenciu analytu a môže zmeniť selektivitu niektorých analytov. Vzorky obsahujúce rozpustené látky s nabitými funkčnými skupinami ako sú amíny, karboxylové kyseliny, fosfáty, fosfonáty, sulfáty a sulfonáty, ionizácia týchto funkčných skupín môže byť ovplyvnená puframi mobilnej fázy.

Napríklad karboxylové kyseliny získavajú záporný náboj so zvyšovaním pH mobilnej fázy nad pKa týchto kyselín, čím sa celé molekuly stanú viac polárnymi a stacionárna fáza ich nedokáže zadržať. Čiže, zvýšenie pH mobilnej fázy nad pH = 4 - 5 (čo je typický pKa interval karboxylových skupín) povedie na zvýšenie ich ionizácie a tým na zníženie retencie. Opačne, použitím mobilnej fázy s pH nižším ako 4 docielime zvýšenie ich retencie na kolóne, pretože sa zníži ich stupeň ionizácie, čím sa stanú menej polárnymi.

Rovnaké úvahy platia pre látky obsahujúce zásadité funkčné skupiny, ako sú amíny, ktorých rozsahy pKa sú okolo 8 a vyššie, sú zadržiavané v kolóne viac, keď sa pH mobilnej fázy zvýši a blíži sa k 8 a viac, pretože sú menej ionizované, teda menej polárne. Avšak v prípade mobilných fáz s vysokým pH je použitie kolón s reverznou fázou na báze silikagélu všeobecne neoporúčané, preto je kontrola retencie amínov v tomto rozsahu obmedzená.

Výber typu pufra je dôležitým faktorom pri vývoji metódy separácie RPLC, pretože môže ovplyvniť retenciu, selektivitu a rozlíšenie sledovaných analytov. Pri výbere pufra pre RP-HPLC je potrebné zvážiť množstvo faktorov, vrátane:

• Požadované pH mobilnej fázy: Pufre sú najúčinnejšie okolo ich hodnoty pKa, preto je dôležité vybrať pufor s hodnotou pKa, ktorá je blízka požadovanému pH mobilnej fázy.
• Rozpustnosť pufra v organickom rozpúšťadle: Pufor musí byť kompatibilný s organickým rozpúšťadlom, ktoré sa používa v mobilnej fáze, väčšinou s bežnými organickými rozpúšťadlami uvedenými vyššie, acetonitrilom, metanolom a izopropanolom.
• UV cut-off tlmivého roztoku : V prípade UV detekcie by tlmivý roztok mal mať UV absorpciu, ktorá je pod detekčnou vlnovou dĺžkou sledovaných analytov. Tým sa zabráni tomu, aby pufor interferoval s detekciou týchto analytov.

• Kompatibilita tlmivého roztoku s detektorom : Ak sa na detekciu používa hmotnostná spektrometria (MS), tlmivý roztok musí byť kompatibilný s hmotnostným spektrometrom. Niektoré tlmivé roztoky, ako napríklad tie, ktoré obsahujú fosfátové soli, nemožno použiť s detektormi MS, pretože nie sú prchavé a interferujú s detekciou MS potlačením ionizácie analytov, čím sa analyty stávajú nedetegovateľnými pomocou MS.

Niektoré z najbežnejších pufrov používaných v RP-HPLC zahŕňajú:

• Fosfátové pufre : Fosfátový pufor je všestranný a možno ho použiť na dosiahnutie širokého rozsahu hodnôt pH vďaka trom hodnotám pKa trojsýtnej kyseliny fosforečnej. Majú tiež veľmi nízke UV pozadie pre UV detekciu. Nie sú však vhodné na detekciu MS.
• Acetátové pufre : Acetátové tlmivé roztoky sú tiež všestranné a možno ich použiť na dosiahnutie rozsahu hodnôt pH typicky používaných v RPLC. Z hľadiska UV detekcie pri vlnovej dĺžke pod 220 nm to nie je také priaznivé. Pufor octanu amónneho je kompatibilný s MS.
• Formiátové pufre: Formiátové pufre sú podobné acetátovým pufrom, pokiaľ ide o rozsah použitých pH a obmedzenú UV detekciu pod 225 nm.
• Amónne pufre : Amónne pufre sú prchavé a často sa používajú v metódach LC-MS. Sú tiež obmedzené na nízku UV detekciu.

Nabité analyty možno separovať na kolóne s reverznou fázou pomocou iónového párovania (tiež nazývaného iónová interakcia). Táto technika je známa ako chromatografia s iónovým párovaním s reverznou fázou.

Elúcia môže byť uskutočnená izokraticky (zloženie voda-rozpúšťadlo sa počas separačného procesu nemení) alebo použitím gradientu roztoku (zloženie voda-rozpúšťadlo sa počas separačného procesu mení, zvyčajne znížovaním polarity mobilnej fázy, čiže zvyšovaním objemového percenta organického rozpúšťadla v mobilenj fáze).

Externé odkazy

• Tabuľky zhrňujúce rôzne typy reverzných fáz a informácie o procese funkcionalizácie